การวินิจฉัยโรคไมโคแบคเทอริโอซิสในปลา

การวินิจฉัยโรคไมโคแบคเทอริโอซิสในปลา

Mycobacteriosis เป็นโรคที่เกิดอย่างเรื้อรังมีสาเหตุจากแบคทีเรียมใน Genus Mycobacteriumเชื้อที่พบว่าก่อโรคในปลาได้แก่ M. marinum, M. fortuitum และ M. chelonae ซึ่งสามารถแบ่งย่อยลงไปได้อีก นอกจากนี้ยังมีรายงานการก่อโรคจากเชื้อตัวอื่นๆ รวมทั้งชนิดใหม่ เช่น M. Chesapeake และ M. shottii เกิดโรคได้ทั้งในปลาน้ำจืด และน้ำเค็ม อาการที่พบ ได้แก่ ตาโปน เกิดแผลหลุด และถูกทำลาย ผอมหรือน้ำหนักต่ำกว่าเกณฑ์ เบื่ออาหาร มีแผลตามตัวจนกระทั่งเห็นเป็นแผลหลุม หลายตัวอย่างก็จะพบอาการท้องมาน พบตุ่มนูนบนผิวหนัง เมื่อผ่าซากอาจจะพบหรือไม่พบตุ่มสีขาวจนถึงเหลืองกระจายทั่วไปในช่องท้อง อวัยวะภายใน ทั้ง ตับ ไตและม้าม พบได้บ่อย ตับ ม้าม และไตมักจะโต เปลี่ยนสี อาจซีดหรือแดงคล้ำ อาจพบการคั่งเลือดและการอักเสบที่รุนแรงในช่องท้อง จนอวัยวะติดกัน เมื่อศึกษาทางพยาธิจะพบแกรนูโลม่าขนาดต่างๆที่อวัยวะทั่วไป และขบวนการอักเสบ ไม่ขอกล่าวในรายละเอียด การติดต่อโดยการกิน ทางการสัมผัสบาดแผล เป็นสำคัญ และยังติดไปยังไข่และอสุจิได้ด้วย

 

การวินิจฉัย เราอาจจะสับสนกับโรคอื่นๆ ที่มีอาการใกล้เคียงกัน เช่น โรค Bacterial kidney disease จากเชื้อ Renibacterium salmoninarum และโรค Nocardiosis และโรคที่ทำให้เกิดแบบเรื้อรังอื่นๆ ที่มีผลให้ร่างกายตอบสนองแบบสร้างแกรนูโลม่า  

การเก็บตัวอย่างและขั้นตอนการวินิจฉัย

 การเก็บตัวอย่างถือว่ามีความสำคัญมาก เพราะปลาบางตัวไม่แสดงอาการให้เห็นเลย ปริมาณเชื้อก็มีเพียงน้อยนิดในร่างกาย เพราะเชื้อเป็นพวกเจริญเติบโตช้าและก่อโรคอย่างช้าๆนั่นเอง หากเราสามารถเก็บด้วยวิธี aseptic ก็จะเป็นประโยชน์มากเลย แต่โอกาสปนเปื้อนสูงมาก และแบคทีเรียที่ปนเปื้อนมักจะเจริญเติบโตในอาหารเลี้ยงเชื้อได้ดีกว่าเชื้อที่เราหา ผลที่ได้ก็คือเราไม่พบทั้งที่อาจจะเป็นตัวก่อโรค อวัยวะที่มักจะเก็บก็คือไต แต่ผมเก็บเกือบทุกอวัยวะ ยิ่งหากพบว่ามีตุ่มรอยโรคอยู่ก็เก็บตรงนั้น รวมทั้งรอยโรคที่ผิวหนัง และน้ำในลูกนัยน์ตา

 

Identification of Mycobacterium.

1. Isolation procedures.

            เมื่อได้เนื้อเยื่อมาแล้วก็นำมา Homogenization ก่อน  เพื่อให้เนื้อเยื่อย่อย และปลดปล่อยเชื้อออกมาจากเนื้อเยื่อแกรนูโลม่า หากจะนำไปศึกษา PCR ก็ต้องใช้ butterfield buffer หากไม่ทำ ก็สามารถบดด้วยสารเคมีที่จะทำ decontamination เลยก็ได้     คือทำไปพร้อมกันในขบวนการเดียวกัน (ผมทำบ่อย) คือบดเนื้อเยื่อลงใน 4%NaOH เป็นเวลา 10 นาที หรือจะเลือกที่ความเข้มข้นต่ำกว่านี้คือ 2%NaOH นานเป็น 12 นาที ก็ได้ ผมมักจะใช้ความเข้มข้นสูงในกรณีที่มีโอกาสปนเปื้อนสูง แต่อาจทำให้เชื้อแบคทีเรียบางตัวตาย หรือเจริญเติบโตได้ช้ามาก (แต่เชื้อจะค่อนข้างทน ประมาณ60 นาทีในบางรายงาน) และยังมีอีกหลายตัวที่ใช้กันได้

 

            หลังจากนั้นก็เขี่ยเชื้อลงในอาหารเลี้ยงเชื้อเฉพาะสำหรับเชื้อไมโคแบคทีเรีย เช่น  1%Ogawa media, Middlebrook 7H10 with OADC และ Lowenstein-Jensen medium อาหารพวกนี้จะมีมาลาไคท์กรีนหรือ tween อยู่เป็นตัวกำจัดเชื้อปนเปื้อน แต่โดยประสบการณ์ของผมที่ใช้อาหารเหล่านี้อยู่ พบว่าเชื้อแบคทีเรียบางชนิดสามารถเจริญได้ดีในอาหารเหล่านี้ ขั้นตอนการdecontamination จึงยังมีความสำคัญ และหากอยู่ในภาคสนาม ขั้นตอนยุ่งยาก หรือเก็บแบบ aseptic แล้วก็สามารถใช้อาหารเลี้ยงเชื้อจำเพาะเหล่านี้ได้โดยตรง และที่สำคัญควรใช้ BHI ร่วมด้วย เพื่อ monitor ว่ามีการปนเปื้อนเชื้อชนิดอื่นอยู่หรือไม่ ถ้าจะให้เยี่ยมไปเลย   BHI ควรเพิ่มกลีเซอรอลไปด้วย 0.5% บางรายงานใส่เยอะมาก 5% ก็ไม่เป็นไร แต่เปลือง (..ฮา..ฮา) เพื่อเป็นแหล่งคาร์บอน หลังจากนั้นก็นำไป incubate ที่ 30 หรือ 32 องศาเซลเซียส บ้านเราหายาก ก็สามารถใช้อุณหภูมิห้องได้ (หยวนๆ แต่อย่าสูงมากเชื้อบางชนิดตายหรือไม่เจริญ แต่เชื้อที่พบในสัตว์ปีกหรือสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ชอบอุณหภูมิสูง) หลังจากนั้นก็รอนาน หากเป็นพวกเจริญเร็ว อย่างเช่น M. fortuitum หรือ M. chelonae ก็รอไม่เกินสัปดาห์ ก็จะเห็นโคโลนีได้ หากเป็นพวกเจริญช้าอย่างเช่น M. marinum หรือM. tuberculosis ก็อาจจะถึงเดือนหรือสองเดือน

 

เนื่องจากต้องรอนานแบบนี้ หลายคนจึงนิยมเลือกวิธีที่รวดเร็วกว่านี้ เช่น ทำ PCR sequence, thin layer chromatography หรืออื่นๆ ไม่กี่วันก็ทราบผลแต่บ้านเราก็ลำบากหน่อย วิธีที่ภาคสนามสามารถทำได้รวดเร็วก็คือการทำ wet smear จากไต ม้ามหรือตับโดยตรง หรือทำ biopsy แล้วนำไปย้อมสี acid-fast staining หรือ Ziehl-neelsen stain ก็จะสามารถเห็นเชื้อย้อมติดสี carbon fuchin ได้ ซึ่งเป็นคุณสมบัติของเชื้อไมโคแบคทีเรีย เพราะผนังเซลล์ และเซลล์มีไลปิดอยู่สูงและทนต่อการ decolorize จากกรดหรือเบสสูง ซึ่งคุณสมบัตินี้ไม่มีในเชื้อกลุ่มอื่น แม้กระทั่ง Nocardia spp.

 

            หากย้อมติดสีแดง   ก็หมายถึงให้ผลบวกต่อ acid-fast   ในกรณีที่ต้องศึกษาในโคโลนี หลังจากที่เลี้ยงเชื้อจนเจริญดีแล้ว ก็ต้องทำการ purification เสียก่อน หลังจากนั้นก็ทำการย้อมแกรม ศึกษาการเคลื่อนที่ (motility test) และ acid-fast หากพบว่าเป็นแกรมบวก ไม่เคลื่อนที่ และ acid-fast เป็นบวก ก็คือกลุ่มใน Genus Mycobacterium

หลังจากนั้นหากจะศึกษาถึงระดับชนิดโดยวิธีทาง biochemical และ biophysiological characteristics ของเชื้อก็สามารถทำได้ (ยังไม่ขอกล่าววิธีอื่นในที่นี้) โดยแรกสุดทำการศึกษาอัตราการเจริญของเชื้อ และการสร้างเม็ดสีของเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อ ตามไดอะแกรม หากเป็นพวกเจริญช้าและ photochromogenic คืออยู่ที่มืดไม่มีแสงจะให้โคโลนีสีขาว แต่เมื่อถูกแสงกระตุ้นก็จะเปลี่ยนเป็นโคโลนีสีเหลือง เช่น M. marinum หรือ M. simiae ที่เจอในลิงและคน หากให้โคโลนีขาวทั้งที่ถูกแสงกระตุ้นและในที่มืด ก็จะเป็นพวก nonphotochromogenic เช่น M. tuberculosis,  M. bovis เป็นต้น และหากให้โคโลนีสีเหลืองทั้งในที่มืดและสว่างก็จะเป็นพวก scotochromogenic เช่น M. scrofulaceum หากเป็นพวกเจริญเร็ว ซึ่งมักจะเป็นพวก nonphotochromogenic เช่น M. fortuitum, M. chelonae เป็นต้น ซึ่งเป็นการแบ่งกลุ่มแบบ Runyon group ซึ่งไม่นิยมใช้ในปัจจุบัน อย่างไรก็ตามสามารถนำมาใช้เพื่อประกอบความเข้าใจอย่างง่ายในการปฏิบัติ หลังจากนั้นก็เลือกการทดสอบ (หรือทำไปพร้อมกันตั้งแต่แรก) ทางbiochemical test เช่น Niacin accumulation, Nitrate reduction, 68C Catalase, Tween hydrolysis, Tellurite reduction, Tolerance to 5%NaCl, Arylsulfatase reduction, Urease utilization, PAS และ resists inhibition by Picric acid เป็นต้น และยังมีให้เลือกมากมายเพื่อลงไปชนิดย่อย ซึ่งบางการทดสอบก็มีชุด kits ให้ใช้อย่างง่าย

 

จบแล้วครับ หวังว่าเป็นประโยชน์ไม่มากก็น้อย ลองเอาไปปฏิบัติดู แล้วมาเล่าสู่กันฟังบ้าง นะครับ

 

By: หมอแก้ว